2.结果与分析

2.1 pH对PPP-NP粒径和Zeta-电位的影响

蛋白质热聚集颗粒的形成是蛋白质分子之间的静电和疏水相互作用的一种竞争现象。当蛋白质溶液中的亲水基团能够提供足够的排斥力时，蛋白质的聚集就会停止。相反，当疏水基团的作用很强时，会给蛋白质的聚集带来动力。粒径和多分散性系数（Polydispersity index，PDI）测量通常用于表征溶液中的聚合物聚集情况；Zeta-电位用于表征溶液的电负性，分析溶液中分子间的静电相互作用。研究表明，蛋白质分子之间的作用力不仅与它们自身的特性有关，而且还取决于外部的加工环境条件。

图1A测定了不同pH对PPP-NP粒径的影响。

如图1A所示，PPP-NP的粒径在45~120 nm之间，在pH6.5时，PPP溶液的粒径在110 nm左右，且拥有最低的PDI（0.19），表明PPP在pH6.5下形成的PPP-NP是分布最均一的。由图1B可知，PPP-NP电位的绝对值随着pH的增加而增大，大豆蛋白热聚集体也有相同的趋势。在pH4.0时，Zeta-电位值为正，主要是由于此时pH<5.5（PPP的等电点（Isoelectric point，pI）为5.5），溶液带正电荷；当pH≥6.5时，Zeta-电位的绝对值随pH增大的原因是此时溶液距离pI越来越远，携带更多的负电荷。综上所述，在pH6.5下PPP-NP粒径最大，为110 nm。且PDI值最低，说明在此pH下，PPP-NP的粒径分布集中，分散性好。

2.2 PPP-NP的表面形貌

用场发射扫描电子显微镜研究的PPP-NP的形态如图2所示。根据粒径结果，可得出pH6.5下PPP-NP的PDI值低，粒径分布集中，因此以pH6.5制备的PPP-NP为代表。由图2A所示，此条件下PPP-NP尺寸均匀。在图2B放大5万倍下更为清晰地观察到这一现象。颗粒尺寸大小和分布情况符合图2A的结果。这些PPP-NP以适当的尺寸制造以稳定Pickering乳液。

由图2A可知PPP-NP的粒径大小在45~120 nm之间，较小的颗粒具有较快的吸附动力学，它们可以更快更准确地吸附在水包油界面上，从而使界面得到更大程度的填充，从而形成更稳定的Pickering乳液。均一的粒径分布和低PDI值是稳定Pickering乳液的关键。在pH6.5下制备的PPP-NP不仅粒径分布均匀一致，并且兼具吸附动力学优势，因此具有更高的应用价值。

2.3 pH对PPP-NP二级结构的影响

使用远紫外圆二色光谱测量pH对PPP-NP二级结构的影响。图3为圆二色光谱图，表1为二级结构的定量分析。由表1可知，PPP含有α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲四种二级结构组分：α-螺旋和β-折叠代表蛋白质的有序结构；β-转角和无规卷曲则代表蛋白质的无序结构。与未经任何处理的对照（control group，con）相比，在调节pH后经过加热的样品，α-螺旋结构含量显著减少约19.2%~34.5%，β-折叠含量显著增加6.9%~47.2%，无规卷曲含量降低8.7%~20.2%。α-螺旋减少的原因是由于热处理会导致α-螺旋中的氢键损伤，而氢键是稳定蛋白质二级结构的主要作用力。

β-折叠含量增加是由于热处理能打开蛋白结构，暴露疏水性基团，增强了蛋白质间的相互作用，进而通过分子间β-折叠形成蛋白聚集体。与中性和碱性条件相比，酸性（pH4.0）条件下的α-螺旋含量较低，这可能是由于α-螺旋主要是由氢键稳定的，而PPP的pI约5.5，此时蛋白是带负电荷，酸性环境可能会增加由于电荷中和而增加蛋白质之间的静电作用力，从而影响氢键的稳定性。静电作用力和氢键的变化会导致酸性条件下α-螺旋的损失。研究表明，其他来源的蛋白二级结构变化也有相似的规律，例如，Wu等将芸豆蛋白进行低pH热处理，蛋白结构发生变形和重组，从而使β-折叠含量增加。在pH6.5~8.0范围内，α-螺旋和β-折叠含量变化不显著，说明在此范围内的pH的变化不足以引起蛋白质二级结构的变化。并且，在此范围内，pH6.5下PPP-NP的β-折叠含量相对最高。已经有相关研究表明，β-折叠含量的增加可能会提高颗粒的界面吸附能力。因此，pH6.5下PPP-NP具有较强的降低界面张力能力，这与后面的界面吸附特性实验结果相互论证。

2.4 pH对PPP-NP界面吸附特性的影响

由于从乳液界面去除吸附颗粒需要巨大的解吸能量，因此颗粒的界面吸附被认为是一个不可逆的过程。PPP-NP在油-水界面的吸附可能包括至少两个阶段：第一阶段PPP-NP接近乳液界面并渗透到油-水界面，第二阶段颗粒附着在界面，导致粘弹性界面膜的形成。由于乳化剂的界面特性是评估其稳定乳液能力的关键因素，因此测定了不同pH条件下PPP-NP的界面张力的变化。

如图4所示，所有样品在前200 s内界面张力值急剧下降，这是由于PPP-NP开始附着在油水界面上。界面张力的快速下降是PPP-NP具有有效乳化剂的一个基本特征。随后，界面张力值下降速度减慢直至达到平衡，这是由于颗粒在油水界面的堆积和结构重排，接近平衡状态意味着颗粒即将终止分子构象的重排。在所有pH条件下，界面张力值均随着时间的推移而降低，表明PPP可以在各种pH条件下在油水界面处吸附。界面张力的降低会降低吉布斯表面自由能，从而提高界面层的稳定性。与con相比，所有样品的最终平衡值均小于con，这可能是由于con未经加热处理，而实验组在热处理过程中球状蛋白质的展开（以及疏水部分的暴露）的结果，说明PPP-NP的乳化性优于PPP。有些蛋白加热聚集后降低界面张力的能力增加，因此稳定油水界面能力增强，乳化性和乳化稳定性改善。